Бактериофаги (фаги) (от греч. φάγος - пожирать) - вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего, бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис.
Бактериофагия - процесс взаимодействия фагов с бактериями, заканчивающийся очень часто их разрушением (от лат. bacteriophage - пожирающий бактерии).
1896 год - открытие бактериофагов Британским бактериологом Эрнестом Ханкин.
1898 год - бактериофаги исследованы российским ученым Николаем Гамалея. В этом же году фаги стали использовать при лечении ран и различных инфекций.
1920-е годы - Феликс Д"Эрель - канадский сотрудник Института Пастера (Париж) назвал бактериофаги «бактериофагами» и охарактеризовал их: «вирусы, размножающиеся в бактериях».
1940-е годы - везде, кроме СССР разработки бактериофагов вычеркнуты из числа перспективных исследований. В СССР исследования продолжаются.
Во всем мире популярность приобретает метод применения антибиотиков.
1980-е годы Эффективность лечения антибиотиками значительно понизилась. Бактерии выработали лекарственную устойчивость.
Интерес к фаговой терапии возобновился.
Начало 2000-х годов - Гленн Моррис - сотрудник Университета Мэриленд (США) совместно с НИИ бактериофагов, микробиологии и вирусологии в Тбилиси наладил испытания фаговых препаратов для получения лицензии на их применение в США.
Июль 2007 года- бактериофаги одобрены для использования в США.
На протяжении последних нескольких лет исследования свойств бактериофагов проводятся в России, Грузии, Польше, Франции, Германии, Финляндии, Канаде, США, Великобритании, Мексике, Израиле, Индии, Австралии.
Явление бактериофагии наблюдали многие ученые. Однако до появления краткой, но яркой статьи Туорта (1915) изучением этих явлений не занимались. Английский бактериолог Туорто писал острую инфекционную болезнь стафилококков, которая вызывала значительные изменения морфологии колоний. Инфекционный агент проходил через фильтры, и его можно было пассировать от одной колонии к другой. Туорт выдвинул несколько гипотез для объяснения этого явления, в том числе и гипотезу о фильтрующемся вирусе, аналогичном патогенным вирусам растений и животных. В замечательной статье Туорта заключена сущность современного взгляда на природу бактериофага, однако эта статья в свое время не привлекла внимания ученых, а Туорт не продолжил свою работу, может быть, потому, что служил в это время в армии.
В 1917 г. канадский бактериолог Феликс Д"Эрелль. работавший в институте Пастера в Париже, независимо от Туорта сообщил в печати об открытии «бактериофага». В ряде интересных работ он описал и правильно истолковал многие факты, касающиеся действия бактериофага, а в 1921 г. опубликовал свой классический труд по этому вопросу.
Под влиянием сообщения о том, что чума свиней вызывается синергическим действием микроба и вируса, Д"Эрелль занялся поисками доказательств подобной же смешанной этиологии бациллярной дизентерии человека.
Занимаясь изучением дизентерии, Феликс Д"Эрелль задумался над вопросом: почему возбудитель этой болезни, высевающийся в ее начале в большом количестве, в конце заболевания очень часто перестает выделяться? Заподозрив здесь действие какого - то агента, Д"Эрелль решил его обнаружить. С этой целью к свежей бульонной культуре дизентерийной палочки он стал добавлять по нескольку капель фильтрата испражнений больного. После одного из таких посевов Д"Эрелль и обнаружил этот агент по его способности разрушать дизентерийные бактерии. При добавлении к мутной бульонной культуре он вызвал ее просветление, а при добавлении к культуре, засеянной на плотную среду, появлялись прозрачные (стерильные) пятна - колонии. Способность вызывать такие пятна и размножаться при повторных посевах дали основание считать его живым корпускулярным агентом. Д"Эрелль назвал его Bacteriophagum intestinale, т. е. выделенный из кишечника пожиратель бактерий. Последующие наблюдения показали, что бактериофаги распространены повсеместно. Они встречаются всюду, где есть бактерии - в почве, воде, кишечном тракте человека и животных, гнойных выделениях и т. п. Особенно много фагов в сточных водах; из этого источника можно выделить практически любой фаг. Поскольку естественной средой обитания любого фага является микробная клетка, жизнь фагов связана с бактериями.
В период между 1920 и 1940 гг. было проведено очень много работ, посвященных изучению возможности применения бактериофагов с терапевтической целью. В большинстве случаев результаты оказались сомнительными или неутешительными, но при некоторых заболеваниях, например при холере, удалось получить терапевтический эффект. С открытием более действенных химиотерапевтических препаратов интерес к применению фага значительно уменьшился. Первоначальные надежды на эффективность применения фага в медицине послужили стимулом для проведения многих ценных работ, касающихся специфичности, иммуногенности, стабильности и изменчивости, а также других свойств бактериофагов. В списке литературы по фагу значатся имена многих известных бактериологов и иммунологов - Борде. Круц, Дёрр, А. Флеминг, Одюруа, Левадити, Праусниц, Топлн, но лишь немногие ученые посвятили всю свою деятельность изучению фагов. Кроме ДЭрелля, это были Ашешов. Бронфенбреннер, Флу, Грациа, Е. Вольман и Е. Вольман (старшие). Эти ученые, интересовавшиеся биологией бактериофагов и возможностью их практического применения, внесли большой вклад в учение о фагах. Затем изучением фага занялись ученые, которые сочетали в своей работе биологическую «интуицию» с применением современных количественных методов исследования: Бернет, Шлезингер, Эндрьюс.
Теория происхождения
В своей первой работе Туорт (1915), рассматривая природу открытого им тогда еще не имевшего названия литического фактора, задавался вопросом - подобен ли этот фактор бактериям, простейшим или фильтрующимся вирусам; не является ли он фильтрующейся стадией жизненного цикла пораженного микрококка или, быть может, это бактериальный фермент, образующийся аутокаталитически при разрушении продуцирующего его микроорганизма. Ряд более тщательно разработанных гипотез приведен в к ниге ДЭрелля (1926). Из них только две сохранили свое значение до настоящего времени: «теория предшественника» и «теория вируса». Живая полемика между сторонниками этих двух теорий длилась много лет; она явилась стимулом для проведения многочисленных экспериментальных работ и породила специальную терминологию.
Согласно теории предшественника, бактериофаги возникают эндогенно: они существуют в бактериях в виде предшественников, которые спонтанно или под влиянием какого-то воздействия превращаются в характерные литические вещества, подобно тому как трипсиноген превращается в трипсин. Эту теорию поддерживали Гильдемейстер (1921), Борде (1925), Нортроп (1939а), Крюгер и Скрибнер (1939), а также Феликс (1953). В большинстве случаев экспериментальное подтверждение этой точки зрения получали при изучении лизогенных бактерий, что и будет рассмотрено ниже.
Признание того факта, что умеренные фаги способны существовать в трех различных состояниях, служит основой для объединения теории предшественника и теории вируса. Эндогенный предшественник в лизогенных бактериях - это по сути дела профаг определенного умеренного фага. Возможность такого объединения противоположных взглядов ясно предвидели Вернет и Мак-Ки (1929). Правда, остается невыясненным, в какой степени теория предшественника приложима к объяснению инфекции экзогенными фагами.
Недавно проведенные исследования установили выраженное сходство между физическими, химическими и биологическими свойствами бактериофагов и других вирусов. Благодаря этому сходству бактериофаги часто использовались в качестве модели вирусов животных, как это и было, например, в работах по изысканию противовирусных антибиотиков. Хотя до некоторой степени это было оправдано, вряд ли можно проводить подобную аналогию дальше. Судя по данным, изложенным ниже, вполне возможно, что бактериофаги и другие вирусы произошли от совершенно разных предков. Тому факту, что в известных нам бактериофагах содержится ДНК, тогда как в некоторых типичных вирусах растений и животных содержится РНК, следует, пожалуй, придавать больше значения, чем упомянутому выше, скорее случайному, сходству между бактериофагами и вирусами.
В настоящее время общепризнано, что фаги образуют группу весьма разнообразных по своим свойствам специфических бактериальных вирусов - ультрамикробов, претерпевших длительную эволюцию, связанную с адаптацией и специализацией. Сам Д"Эрелль не полностью разделял эту точку зрения; он считал, что все бактериофаги относятся к одному виду, хотя и представленному большим числом разнообразных форм. Утверждая это, Д"Эрелль и многие другие противники вирусной теории игнорировали или отрицали наиболее веские доводы этой теории, вследствие чего, к сожалению, основные исследования по фагам в течение 10 или более лет оказались бесплодными.
В открытом Д’Эреллем литическом цикле столь ярко выявилась активность бактериофагов, что другие их свойства почти не изучались. И лишь в последние годы, с открытием нелитической фазы фага, в изучении фагов появилось новое направление. Не-которые штаммы бактериофага, попадая в чувствительную культуру бактерий, способны вступать с ней в тесные симбиотические отношения, при которых клетка-хозяин продолжает размножаться, неся в себе вирус в неинфекционном состоянии на протяжении бесконечного числа делений. Это тонко уравновешенная фаза размножения вируса, во время которой инфицированная клетка-хозяин и находящийся в ней профаг размножаются с одинаковой скоростью; данное явление получило название «лизогенности», или «лизогении». Теперь считают, что инфицирование, приводящее к лизогенности, вызывает модификацию генетического аппарата бактериальной клетки и часто приводит к изменению свойств бактерий; в качестве примера укажем на превращение авирулентного штамма дифтерийной бактерии в высокотоксигенный под влиянием заражения соответствующим фагом.
При определенных условиях некоторые бактериофаги поражают и убивают чувствительные бактерии, не вызывая лизиса и не размножаясь. В этом случае фаговая частица ведет себя как антибиотик, а не как вирус. Некоторые антибиотики, продуцируемые бактериями, например колнцины и пиоцины, действительно по ряду свойств напоминают бактериофаги.
Фотография, сделанная с помощью электронного микроскопа, показывает процесс закрепления бактериофагов (колифагов T1) на поверхности бактерии E. coli.
Константин Мирошников
В конце ХХ века стало ясно, что бактерии безусловно доминируют в биосфере Земли, составляя более 90% ее биомассы. У каждого вида имеется множество специализированных типов вирусов. По предварительным оценкам, число видов бактериофагов составляет около 1015. Чтобы понять масштаб этой цифры, можно сказать, что если каждый человек на Земле будет каждый день открывать по одному новому бактериофагу, то на описание всех их понадобится 30 лет. Таким образом, бактериофаги — самые малоизученные существа в нашей биосфере. Большинство известных сегодня бактериофагов принадлежит к отряду Caudovirales — хвостатые вирусы. Их частицы имеют размер от 50 до 200 нм. Хвост разной длины и формы обеспечивает присоединение вируса к поверхности бактерии-хозяина, головка (капсид) служит хранилищем для генома. Геномная ДНК кодирует структурные белки, формирующие «тело» бактериофага, и белки, которые обеспечивают размножение фага внутри клетки в процессе инфекции. Можно сказать, что бактериофаг — это природный высокотехнологичный нанообъект. Например, хвосты фагов представляют собой «молекулярный шприц», который протыкает стенку бактерии и, сокращаясь, впрыскивает свою ДНК внутрь клетки.
Бактериофаги для размножения используют аппарат бактериальной клетки, «перепрограммируя» его на производство новых копий вирусов. Последний этап этого процесса — лизис, уничтожение бактерии и освобождение новых бактериофагов.
Фотография, сделанная с помощью электронного микроскопа, показывает процесс закрепления бактериофагов (колифагов T1) на поверхности бактерии E. coli.
Все эти молекулярные тонкости не были известны во втором десятилетии ХХ века, когда были открыты «невидимые инфекционные агенты, уничтожающие бактерий». Но и без электронного микроскопа, с помощью которого в конце 1940-х впервые удалось получить изображения бактериофагов, было понятно, что они способны уничтожать бактерии, в том числе и болезнетворные. Это свойство было незамедлительно востребовано медициной. Первые попытки лечения фагами дизентерии, раневых инфекций, холеры, тифа и даже чумы были проведены достаточно аккуратно, и успех выглядел вполне убедительно. Но после начала массового выпуска и использования фаговых препаратов эйфория сменилась разочарованием. О том, что такое бактериофаги, как производить, очищать и применять их лекарственные формы, было известно еще очень мало. Достаточно сказать, что по результатам предпринятой в США в конце 1920-х годов проверки во многих промышленных фагопрепаратах собственно бактериофагов вообще не оказалось.
Проблема с антибиотиками
Вторую половину ХХ века в медицине можно назвать «эрой антибиотиков». Однако еще первооткрыватель пенициллина Александр Флеминг в своей нобелевской лекции предупреждал, что устойчивость микробов к пенициллину возникает довольно быстро. До поры до времени антибиотикоустойчивость компенсировалась разработкой новых типов противомикробных лекарств. Но с 1990-х годов стало ясно, что человечество проигрывает «гонку вооружений» против микробов. Виновато прежде всего бесконтрольное применение антибиотиков не только в лечебных, но и в профилактических целях, причем не только в медицине, но и в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и быту. В результате устойчивость к этим препаратам начала вырабатываться не только у болезнетворных бактерий, но и у самых обычных микроорганизмов, живущих в почве и воде, делая из них «условных патогенов». Такие бактерии комфортно существуют в медицинских учреждениях, заселяя сантехнику, мебель, медицинскую аппаратуру, порой даже дезинфицирующие растворы. У людей с ослабленным иммунитетом, каких в больницах большинство, они вызывают тяжелейшие осложнения.
Бактериофаг — не живое существо, а молекулярный наномеханизм, созданный природой. Хвост бактериофага — это шприц, который протыкает стенку бактерии и впрыскивает вирусную ДНК, которая хранится в головке (капсиде) внутрь клетки.
Неудивительно, что медицинское сообщество бьет тревогу. В прошедшем, 2012 году гендиректор ВОЗ Маргарет Чен выступила с заявлением, предсказывающим конец эры антибиотиков и беззащитность человечества перед инфекционными заболеваниями. Впрочем, практические возможности комбинаторной химии — основы фармакологической науки — далеко не исчерпаны. Другое дело, что разработка противомикробных средств — очень дорогой процесс, не приносящий таких прибылей, как многие другие лекарства. Так что страшилки о «супербактериях» — это скорее предостережение, побуждающее людей к поискам альтернативных решений.
На медицинской службе
Вполне логичным выглядит возрождение интереса к использованию бактериофагов — естественных врагов бактерий — для лечения инфекций. Действительно, за десятилетия «эры антибиотиков» бактериофаги активно служили науке, но не медицине, а фундаментальной молекулярной биологии. Достаточно упомянуть расшифровку «триплетов» генетического кода и процесса рекомбинации ДНК. Сейчас о бактериофагах известно достаточно, чтобы обоснованно выбирать фаги, подходящие для терапевтических целей.
Достоинств у бактериофагов как потенциальных лекарств множество. Прежде всего — это их несметное количество. Хотя изменять генетический аппарат бактериофага тоже намного проще, чем у бактерии, и тем более — у высших организмов, в этом нет необходимости. Всегда можно подобрать что-то подходящее в природе. Речь идет скорее о селекции, закреплении востребованных свойств и размножении нужных бактериофагов. Это можно сравнить с выведением пород собак — ездовых, сторожевых, охотничьих, гончих, бойцовых, декоративных… Все они при этом остаются собаками, но оптимизированы под определенный вид действий, нужных человеку. Во‑вторых, бактериофаги строго специфичны, то есть они уничтожают только определенный вид микробов, не угнетая при этом нормальную микрофлору человека. В-третьих, когда бактериофаг находит бактерию, которую должен уничтожить, он в процессе своего жизненного цикла начинает размножаться. Таким образом, не столь острым становится вопрос дозировки. В-четвертых, бактериофаги не вызывают побочных эффектов. Все случаи аллергических реакций при использовании терапевтических бактериофагов были вызваны либо примесями, от которых препарат был недостаточно очищен, либо токсинами, выделяющимися при массовой гибели бактерий. Последнее явление, «эффект Герксхаймера», нередко наблюдается и при применении антибиотиков.
Две стороны медали
К сожалению, недостатков у медицинских бактериофагов тоже немало. Самая главная проблема проистекает из достоинства — высокой специфичности фагов. Каждый бактериофаг инфицирует строго определенный тип бактерий, даже не таксономический вид, а ряд более узких разновидностей, штаммов. Условно говоря, как если бы сторожевая собака начинала лаять только на одетых в черные плащи громил двухметрового роста, а на лезущего в дом подростка в шортах никак не реагировала. Поэтому для нынешних фаговых препаратов нередки случаи неэффективного применения. Препарат, сделанный против определенного набора штаммов и прекрасно лечащий стрептококковую ангину в Смоленске, может оказаться бессильным против по всем признакам такой же ангины в Кемерове. Болезнь та же, вызывается тем же микробом, а штаммы стрептококка в разных регионах оказываются различными.
От автора
Поскольку бактериофагов в природе несметное количество и они постоянно попадают в организм человека с водой, воздухом, пищей, то иммунитет их просто игнорирует. Более того, существует гипотеза о симбиозе бактериофагов в кишечнике, регулирующем кишечную микрофлору. Добиться какой-то иммунной реакции можно только при длительном введении в организм больших доз фагов. Но таким образом можно добиться аллергии на почти любые вещества. И наконец, очень важно то, что бактериофаги недороги. Разработка и производство препарата, состоящего из точно подобранных бактериофагов с полностью расшифрованными геномами, культивированных по современным биотехнологическим стандартам на определенных штаммах бактерий в химически чистых средах и прошедших высокую очистку, на порядки дешевле, чем для современных сложных антибиотиков. Это позволяет быстро приспосабливать фаготерапевтические препараты к меняющимся наборам патогенных бактерий, а также применять бактериофаги в ветеринарии, где дорогие лекарства экономически не оправданы.
Для максимально эффективного применения бактериофага необходима точная диагностика патогенного микроба, вплоть до штамма. Самый распространенный сейчас метод диагностики — культуральный посев — занимает много времени и требуемой точности не дает. Быстрые методы — типирование с помощью полимеразной цепной реакции или масс-спектрометрии — внедряются медленно из-за дороговизны аппаратуры и более высоких требований к квалификации лаборантов. В идеале подбор фагов-компонентов лекарственного препарата можно было бы делать против инфекции каждого конкретного пациента, но это дорого и на практике неприемлемо.
Другой важный недостаток фагов — их биологическая природа. Кроме того, что бактериофаги для поддержания инфекционности требуют особых условий хранения и транспортировки, такой метод лечения открывает простор для множества спекуляций на тему «посторонней ДНК в человеке». И хотя известно, что бактериофаг в принципе не может заразить человеческую клетку и внедрить в нее свою ДНК, поменять общественное мнение непросто. Из биологической природы и довольно большого, по сравнению с низкомолекулярными лекарствами (теми же антибиотиками), размера вытекает третье ограничение — проблема доставки бактериофага в организм. Если микробная инфекция развивается там, куда бактериофаг можно приложить напрямую в виде капель, спрея или клизмы, — на коже, открытых ранах, ожогах, слизистых оболочках носоглотки, ушей, глаз, толстого кишечника — то проблем не возникает.
Но если заражение происходит во внутренних органах, ситуация сложнее. Случаи успешного излечения инфекций почек или селезенки при обычном пероральном приеме препарата бактериофага известны. Но сам механизм проникновения относительно крупных (100 нм) фаговых частиц из желудка в кровоток и во внутренние органы изучен плохо и сильно разнится от пациента к пациенту. Бактериофаги бессильны и против тех микробов, которые развиваются внутри клеток, например возбудителей туберкулеза и проказы. Через стенку человеческой клетки бактериофаг пробраться не может.
Нужно отметить, что противопоставлять применение бактериофагов и антибиотиков в медицинских целях не следует. При совместном их действии наблюдается взаимное усиление противобактериального эффекта. Это позволяет, например, снизить дозы антибиотиков до значений, не вызывающих выраженных побочных эффектов. Соответственно, и механизм выработки у бактерий устойчивости к обоим компонентам комбинированного лекарства почти невозможен. Расширение арсенала противомикробных препаратов дает больше степеней свободы в выборе методики лечения. Таким образом, научно обоснованное развитие концепции применения бактериофагов в противомикробной терапии — перспективное направление. Бактериофаги служат не столько альтернативой, сколько дополнением и усилением в борьбе с инфекциями.
И.М. ЩЕРБЕНКОВ , к.м.н., ЦЭЛТ, Москва
Бактерии, резистентные к большинству или ко всем из всех известных антибиотиков, вызывают все более серьезные проблемы. Это увеличивает риск возврата медицинского сообщества к проблемам того периода, когда антибиотики были неизвестны и широко распространены неизлечимые инфекции и эпидемии. Несмотря на интенсивную работу ведущих химиков и фармацевтов всего мира, за последние 30 лет резко снизился синтез новых классов антибиотиков, и в ближайшее время не предвидится поступления в клиническую практику принципиально новых представителей антибактериальных средств. Есть надежда, что вновь обнаруженная возможность полностью секвенировать микробные геномы и определять молекулярные основы патогенности откроет новые пути лечения инфекционных заболеваний, но все с большим рвением идет поиск других подходов к этой проблеме.
Одним из результатов такого поиска является вновь возникший интерес к возможностям терапевтического использования бактериофагов (от бактерии и греч. phagos пожиратель; букв. пожиратели бактерий) специфических вирусов, которые атакуют только бактерии и убивают патогенные микроорганизмы. Бактериофаги обладают способностью проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вызывать их лизис.
История изучения и применения бактериофагов
В 1896 г. Эрнест Ханкин сообщил, что воды рек Ганга и Джамна в Индии обладают значительной антибактериальной активностью, которая сохранялась после прохождения через фарфоровый фильтр с порами очень малого размера, но устранялась при кипячении. Наиболее подробно изучал он действие неизвестной субстанции на Vibrio cholerae и предположил, что она ответственна за предупреждение распространения эпидемий холеры, вызванных употреблением воды из этих рек. Однако в последующем он не объяснил этот феномен.
В 1898 г. впервые перевиваемый лизис бактерий (сибиреязвенной палочки) наблюдал русский микробиолог Н.Ф. Гамалея.
Официально бактериофаги были открыты почти через 20 лет независимо друг от друга Ф. Туортом совместно с А. Лондом и Ф. д"Эрелем как фильтрующиеся, передающиеся агенты разрушения бактериальных клеток. Английский ученый Ф. Туорт в 1915 г. описал явление лизиса у гнойного стафилококка и открыл первый «вирус, пожирающий бактерии», когда наблюдал любопытное дегенеративное изменение лизис в культурах стафилококков из лимфы теленка. С его именем связано название «феномен Туорта». В 1917 г. Феликс д’Эрель делает аналогичное открытие, именно он дал им название «бактериофаги», используя суффикс «фаг» не в его прямом смысле «есть», а в смысле развития за счет чего-то.
В 1980-е гг. эффективность лечения антибиотиками значительно понизилась, бактерии активно вырабатывают лекарственную устойчивость. Чтобы создать новый сильнодействующий антибиотик, фармацевтические компании сегодня должны в среднем потратить 10 лет и 800 млн долл. Это послужило поводом к повышенному интересу к фаговой терапии. В начале 2000-х гг. Гленн Моррис, сотрудник Университета Мэриленд (США), совместно с НИИ бактериофагов, микробиологии и вирусологии в Тбилиси наладил испытания фаговых препаратов для получения лицензии на их применение в США. И уже в июле 2007 г. бактериофаги одобрены для использования в США. На протяжении последних нескольких лет исследования свойств бактериофагов проводятся в России, Грузии, Польше, Франции, Германии, Финляндии, Канаде, США, Великобритании, Мексике, Израиле, Индии, Австралии.
Характеристика фагов
Применение современных электронных микроскопов, а также усовершенствование методов приготовления препаратов для электронной микроскопии позволили более детально изучить тонкую структуру фагов. Оказалось, что она весьма разнообразна и у многих фагов более сложна, чем структура вирусов растений и ряда вирусов человека и животных. Бактериофаги, как и другие вирусы, несут свою генетическую информацию в форме ДНК либо РНК. Большинство бактериофагов имеют хвостики, кончики которых прикреплены к конкретным рецепторам, таким как молекулы углеводов, белков и липополисахаридов на поверхности бактерии-хозяина. Бактериофаг впрыскивает свою нуклеиновую кислоту в хозяина, где он использует генетический механизм хозяина, чтобы реплицировать свой генетический материал, и считывает его, чтобы сформировать новый фагокапсульный материал для создания частичек нового фага. Число фагов, произведенных в течение единичного цикла инфекции (размер выхода), варьирует между 50 и 200 новыми фаговыми частицами.
Лизогенизация бактерий сопровождается изменением их морфологических, культуральных, ферментативных, антигенных и биологических свойств. Так, например, нетоксигенные штаммы коринебактерий дифтерии в результате лизогенизации превращаются в токсигенные.
Практическое использование фагов
Фаготерапия (применение бактериальных вирусов для лечения бактериальных инфекций) была проблемой, весьма интересующей ученых еще 60 лет назад. Открытие пенициллина и других антибиотиков в 1940-х гг. обеспечило более результативный и многосторонний подход к подавлению вирусных заболеваний и спровоцировало к закрытию работ в данной области.
В связи с катастрофически возрастающей антибиотикорезистентностью и отсутствием в ближайшей перспективе новых антибактериальных средств возродился активный интерес к фаготерапии.
Научные данные последних десятилетий доказывают, что в отличие от антибиотиков препараты бактериофагов имеют следующие положительные качества:
Размножаясь, они самостоятельно регулируют свою численность (увеличивая или уменьшая ее), поскольку размножаются только до тех пор, пока имеются чувствительные бактерии, а затем постепенно элиминируются из организма и окружающей среды;
они гораздо более специфичны, чем большинство антибиотиков; будучи нацелены на конкретные проблемные бактерии, вызывают гораздо меньшее повреждение нормального микробного баланса организма. Бактериальный дисбаланс, или «дисбиоз», вызванный лечением многими антибиотиками, может привести к серьезным вторичным инфекциям с участием достаточно резистентных бактерий, увеличивающим затраты на лечение и летальность. Специфические проблемы, возникающие в результате, включают инфекции, вызванные псевдомонадами, трудно поддающиеся лечению, и Clostridium difficile, причину серьезной диареи и псевдомембранозного колита;
фаги имеют возможность использовать в качестве мишеней рецепторы на бактериальной поверхности, участвующие в патогенезе, а это означает, что вирулентность любых резистентных к ним мутантов ослаблена;
в отношении фаговой терапии описано мало побочных эффектов;
фаговая терапия была бы особенно применима для лиц с аллергией к антибиотикам;
должным образом селекционированные фаги можно легко использовать профилактически, способствуя предотвращению бактериальных заболеваний у людей или животных при контакте с микробами, либо для санации больниц и борьбы с госпитальными инфекциями;
фаг можно использовать либо независимо, либо в сочетании с другими антибиотиками, с целью уменьшения вероятности развития резистентности бактерий;
фаги не воздействуют на нормофлору кишечника и препараты эубиотиков и протобиотиков, что дает возможность для их совместного применения.
Обладая широким спектром антибактериальной активности и клинической эффективности, бактериофаги эффективны против лекарственно-устойчивых организмов, что предоставляет возможность расценивать их как аналоги или заменители антибиотиков и средства противосептической терапии.
Фаготерапия может использоваться профилактически с целью борьбы с распространением инфекционного заболевания там, где источник идентифицирован на ранней стадии, или там, где вспышки случаются внутри сравнительно закрытых организаций, таких как школы или детские сады.
Активность лечебно-профилактических бактериофагов при инфекционных болезнях пищеварительной системы, гнойно-септических заболеваниях кожных покровов, кровеносной системы, дыхательной системы, опорно-двигательного аппарата, мочеполовой системы (более 180 нозологических единиц заболеваний, вызванных бактериями Klebsiella, Escherichiae, Proteus, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Serratia, Enterobacter) довольно высока – от 72 до 90% – и часто является единственным эффективным лечебным средством. Также это касается штаммов больничного происхождения, характеризующихся множественной устойчивостью к антибиотикам.
Препараты бактериофагов
Лечебно-профилактические препараты бактериофагов составлены из поликлональных патогенных бактериофагов обширной сферы действия, действенных относительно антибиотикоустойчивых бактерий. По составу различают поливалентные (активные по отношению к различным видам и сероварам одного возбудителя) и комбинированные (с содержанием фагов к нескольким возбудителям) бактериофаги, что позволяет получить лечебный эффект при наличии микробных ассоциаций. ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России выпускает большой спектр лекарственных бактериофагов: стафилококковый, стрептококковый, коли, протейный, синегнойный, клебсиеллезный, брюшнотифозный, дизентерийный, сальмонеллезный. Имеются и их комбинированные формы: колипротейный бактериофаг, интести бактериофаг (смесь стерильных фильтратов фаголизатов бактерий: Shigella Flexneri 1-6 серогруппы В, Sonnei серогруппы D; Salmonella paratyphi A,B, Typhimurium, Choleraesuis, Oranienburg, Enteritidis, наиболее распространенных серологических групп E. coli – 0111, 055, 026, 125, 0119, 0128, 018, 044, 025, 020, Proteus (vulgaris, mirabilis), Staphylococcus, Pseudomonas, Enterococcus – титр фага не менее 1 х 106).
Препараты бактериофагов представляют собой стерильный фильтрат бактериальных фаголизатов, их прописывают для применения внутрь, местно для орошения повреждений и слизистых, введения в полости матки, мочевого пузыря, уха, придаточных пазух, а также в дренированные полости – брюшную, плевральную, а также в полости нарывов и гнойников после удаления экссудата. Бактериофаги способны стремительно проникать в кровоток, лимфатическую систему, а удаляются из организма вместе с мочой. Соответствие препаратов бактериофагов нынешней атиологической структуре возбудителей достигается производством штаммов, или штаммов-продуцентов, или синтезированного материала, не подлежащего каким-либо трансформациям. Такая пластичность бактериофаговых препаратов обеспечивает продолжительный эффект первичной фагоустойчивости возбудителей. Применение бактериофагов для лечения инфекционных заболеваний инициирует факторы специфического и неспецифического иммунитета, что в особенности результативно для терапии длительных инфекционных заболеваний, возникших в результате ослабления иммунитета на фоне депрессивного расстройства при бактерионосительстве. Научными исследованиями, во время клинических наблюдений, методом эксперимента выявлена несостоятельность плазмид передавать антибиотикам иммунитет к токсигенности профилактико-терапевтическим препаратам бактерионосительства, потому что они являются поликлональными комплексами вирулентных бактериофагов.
При использовании бактериофагов в крупных клиниках целесообразно включать в состав производственных штаммов, на которых готовятся коммерческие препараты, госпитальные штаммы возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний, характерных для данного стационара. Отечественными неонатологами показана высокая эффективность фаготерапии гнойно-септических инфекций у детей раннего возраста. Помимо литического действия на микробы, отмечают их значение в механизме антитоксического, клеточного и гуморального иммунитета. Изучение возможности применения бактериофагов как альтернативы антибиотикотерапии для лечения острой кишечной инфекции (ОКИ) у детей в возрасте до 3 лет, проводимое на кафедре детских инфекционных болезней КНМУ, показало высокую эффективность поливалентного Интести-бактериофага. Был сделан вывод о возможности проведения этиотропной терапии поливалентным Интести-бактериофагом без включения антибиотиков больным ОКИ в легкой и средне-тяжелой форме даже в условиях общего кишечного отделения.
Дисбиоз как актуальная проблема у детей
В последние годы актуальной задачей в педиатрии остается рациональная фармакотерапия дисбиозов различного генеза. В особенности актуальна проблема дисбиоза кишечника у детей раннего возраста. Результаты современных исследований свидетельствуют о наличии дисбактериоза кишечника I-II степени у 50% здоровых детей грудного возраста, III-IV степени - у 20-25% детей. Нарушения микробиоценоза кишечника наблюдают практически при всех заболеваниях детского возраста. При формировании дисбактериоза усугубляется общее состояние пациента, снижается резистентность организма к инфекционным и антигенным агентам, толерантность к пищевым продуктам. Все это создает фон для более тяжелого течения заболеваний, возникновения осложнений, перехода острых форм в хронические. Дети первого полугода жизни особенно подвержены дисбиозу, что обусловлено транзиторной недостаточностью ферментов (в основном лактазы), незрелостью вегетативной нервной системы (ВНС), регулирующей моторику кишечника, несформированностью иммунных механизмов.
Основными причинами возникновения дисбиоза кишечника в детском возрасте являются:
Несвоевременное начало и неправильное ведение лактации;
ранний переход и нерациональное искусственное вскармливание на первом году жизни ребенка и нарушение режима питания в старшем возрасте;
острые кишечные инфекции и заболевания пищеварительного канала неинфекционного характера;
нерациональное применение антибиотиков и других химиотерапевтических препаратов;
аллергическая предрасположенность;
снижение естественной резистентности организма.
Лечение пациентов с дисбиозом кишечника следует проводить дифференцированно и начинать с выявления основного заболевания, без лечения которого признаки дисбиоза рецидивируют. Длительность одного курса лечения детей индивидуальна и колеблется от 10 сут. до 1,52 мес. Повторные курсы проводят после промежуточного бактериологического контроля (исследование кала) не ранее, чем через 2 нед. после окончания курса терапии. Суммарная длительность восстановления (до уровня устойчивой клинической компенсации) зависит от многих сопутствующих факторов и составляет 69 мес.
В современной детской гастроэнтерологии используется широкий арсенал препаратов для коррекции нарушенного микробиоценоза кишечника. В клинической практике педиатры и гастроэнтерологи для коррекции дисбиоза всe чаще используют бактериофаги. Применяют коли-протейный, стафилококковый, синегнойный, поливалентный дизентерийный, сальмонеллезный, комбинированный (смесь стафилококкового, стрептококкового, коли, синегнойного, протейного бактериофагов), поливалентный пиобактериофаг, интестифаг и др. Применение специфических бактериофагов позволяет оптимальным образом осуществить селективную деконтаминацию, проводимую при ряде патологических состояний с целью санирующего эффекта, а также для восстановления нормального микробиоценоза. Являясь безвредным биологическим методом лечения, бактериофаготерапия может применяться у детей раннего возраста. Для получения положительных результатов использования бактериофагов необходимо предварительное исследование чувствительности к ним микроорганизмов.
Коли-протейный бактериофаг жидкий мы применяем при лечении детей с дисбиозом, обусловленным энтеропатогенной кишечной палочкой (эшерихией) и протеем (мирабилис или вульгарным). Бактериофаг назначаем внутрь или в клизме. Суточная доза препарата для применения внутрь: детям в возрасте до 6 мес. 5 мл 3 раза в сутки внутрь и 10 мл 1 раз в сутки в клизме вместо одного из приемов через рот; от 6 мес. до 1 года 1015 мл 2 раза в сутки внутрь и 20 мл 1 раз в сутки в клизме; в возрасте 13 лет 1520 мл 2 раза в сутки внутрь и 40 мл 1 раз в сутки в клизме; старше 3 лет 20 мл 2 -3 раза в сутки внутрь и 40-60 мл 1 раз в сутки в клизме. Внутрь бактериофаг назначают за 1-1,5 ч до еды. Детям первого месяца жизни бактериофаг разводят кипяченой водой в 2 раза. Детям старше 6 мес. за 5-10 мин до введения препарата дают 10-20 мл (в зависимости от возраста) 2-3%-ного раствора натрия гидрокарбоната для нейтрализации желудочного сока. Курс лечения составляет 5-10 сут. в зависимости от степени выраженности дисбиотических нарушений.
В клизме препарат целесообразно применять при отсутствии синдрома мальабсорбции: детям до 6 мес. - 20 мл, от 6 мес. до 3 лет - 30-40 мл, старше 3 лет - 40–50 мл. Препарат вводят 1 раз в сутки 23 курсами продолжительностью 3-4 сут. С интервалом между курсами 3 сут. Противопоказаний к применению препарата нет. Назначение бактериофага не исключает применения других ЛС.
Стафилококковый бактериофаг жидкий мы назначаем внутрь в суточной дозе: детям до 6 мес. - 20 мл, 6 мес. - 3 года - 40 мл, старше 3 лет - 100 мл. Вводят в 2 приема, натощак, за 1,5-2 ч до еды. В клизме в этих же дозах следует вводить 1 раз в сутки по той же схеме.
Поскольку мы в реальной клинической практике при дисбиозах встречаемся с одновременным ростом различных представителей патогенной микрофлоры, важно назначение в подобных случаях с учетом данных бактериологических исследований комбинированных бактериофагов - смеси стафилококкового, стрептококкового, коли, синегнойного, протейного бактериофагов. Их назначают детям в возрасте до 3 лет по 3-5 мл 3 раза в сутки внутрь и 10 мл 1 раз в сутки в клизме; старше 3 лет - 5-10 мл 3 раза в сутки внутрь и 10 мл 1 раз в сутки в клизме. Внутрь назначают за 1 ч до еды. Возможно дополнительное введение комбинированного фага в высокой клизме по 5-20 мл. Курс лечения 5-15 сут.
Интестифаг содержит фаголизаты кишечной палочки, шигеллезы сальмонелл, УПМ. Назначают внутрь за 1 ч до еды детям в возрасте до 3 лет по 3-5 мл 3 раза в сутки внутрь и 10 мл 1 раз в сутки в клизме; детям старше 3 лет - по 5-10 мл 3 раза в сутки внутрь и 10 мл 1 раз в сутки в клизме. Курс лечения 5-6 сут.
Поливалентный пиобактериофаг, или секстифаг - смесь фаголизатов кишечной палочки, клебсиеллы, синегнойной палочки, стафилококка, стрептококка, протея. Данный препарат отличается наиболее высокой степенью очистки от бактериальных метаболитов, что значительно улучшает его вкусовые качества и делает средством первого выбора у детей до года. Назначают: детям в возрасте до 3 лет - 3-5 мл 3 раза в сутки внутрь и 10 мл 1 раз в сутки в клизме; старше 3 лет - 5-10 мл 3 раза в сутки внутрь и 10 мл 1 раз в сутки в клизме. Внутрь применяют за 1 ч до еды. Курс лечения 5-15 сут.
Применение фагов предшествует назначению кислотообразующих препаратов (пребиотиков, пробиотиков и др.).
Заключение
Препараты бактериофагов эффективны при лечении болезней, вызванных антибиотикоустойчивыми штаммами микроорганизмов, в частности при лечении паратонзиллярных гнойников, воспалений пазух носа, а также гнойно-септических инфекций, реанимационных больных, хирургических заболеваний, циститов, пиелонефритов, холециститов, гастроэнтероколитов, дисбактериоза кишечника, воспалительных заболеваний и сепсиса новорожденных. При обширно распространенном формировании стабильности к антибиотикам у патогенных бактерий необходимость в новых антибиотиках и альтернативных технологиях контроля за микробными инфекциями завоевывает все большую значимость. Бактериофагам, вероятно, еще предстоит исполнить свою роль в лечении инфекционных заболеваний как при их независимом применении, так и в сочетании с антибиотико-терапией.
Литература
1. Антибиотики-убийцы: [история открытия, польза и вред, противопоказания, ищем замену, когда нет выхода]. М.: Эксмо, 2007.
2. Приворотский В.Ф., Лупова Н.Е., Шильникова О.В. Логика построения корригирующих медикаментозных программ нарушенного микробиоценоза кишечника у детей // РМЖ. 2007. №1. С. 6–9.
3. Бельмер С.В. Антибиотик-ассоциированный дисбактериоз кишечника // РМЖ. 2004. Т. 12. №3. С. 148–151.
4. Методы нормализации пищеварения у детей с дисбактериозом: пособие для врачей / под ред. академика РАМН А.А. Баранова. М., 2005. С. 38–39.
5. Заболевания кишечника. Справочник для практических врачей «Ремедиум-врач». М.: ООО «Издательство «Ремедиум». С. 74–76.
6. Государственный реестр лекарственных средств. М.: МЗиСР (интернет версия www.drugreg.ru) .
7. Нижевич А.А., Хасанов Р.Ш., Нуртдинова Н.М., Очилова Р.А., Логиновская В.В., Калметьева Л.Р. Антибиотик-ассоциированный дисбактериоз кишечника у детей // РМЖ. 2007. №1. С. 12–15.
8. Щербаков П.Л., Цветков П.М., Нечаева Л.В. Профилактика диареи, связанной с приемом антибиотиков у детей // Вопросы современной педиатрии. 2004. Т. 3. №2.
9. Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии. М.: Практическая медицина, 2006.
10. Зеленин К.Н. Возникновение и развитие химиотерапии.
11. Урсова Н.И. Дисбактериоз кишечника у детей: руководство для практических врачей / под ред. Г.В. Римарчук. М.: «Компания БОРГЕС», 2006.
12. Ларчини Д., Паренти Ф. Антибиотики / пер. с англ. Ю.В. Дудника. М.: Мир, 1985.
13. Клинико-иммунологическая эффективность иммунобиологических препаратов / под ред. М.П. Костинова и И.В. Медуницына. М.: Миклош, 2004. С. 195–206.
14. Стент Г. Молекулярная биология вирусов бактерий / пер. с англ. М., 1965.
15. Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов / пер. с англ. М., 1965.
16. Шлегель Г. Общая микробиология / пер. с нем. М., 1987. С. 142.
Константин Мирошников
Феликс Хьюберт Д’Эрель (Fйlix Hubert d’Hйrelle) французский и канадский микробиолог. Открыл бактериофаги. Детально описал бактериофагию. Предложил использовать бактериофаги для лечения инфекционных заболеваний.
Д’Эрель родился в Монреале, Квебеке (Канада) в 1873 году в семье французских эмигрантов. После смерти отца семья переехала в Париж, где Д’Эрель закончил среднюю школу. Другого образования он не получил, и всю жизнь занимался самообразованием. Д’Эрелль всегда был охвачен страстью к путешествиям: в 16 лет он объездил пол-Европы на велосипеде, в 17 путешествовал по Южной Америке. Эта склонность к перемене мест владела ученым до конца дней - он работал по всему миру. В возрасте 24 лет Д’Эрелль с семьей переехал в Канаду. Для заработка он изучал процессы изготовления шнапса из кленового сиропа, а в свободное время устроил у себя дома лабораторию и занимался микробиологией. Одно время он работал как санитар в геологической экспедиции в Лабрадоре, не имея никакой медицинской степени или реального опыта. В попытке решить финансовые проблемы он уехал с семьей в Гватемалу, получив должность бактериолога при столичной больнице. Там, помимо основной деятельности, Д’Эрелль изучал вопрос о получении виски из бананов. Этот опыт помог ему получить новую работу: мексиканское правительство пригласило его заняться темой «Шнапс из агавы». Мексиканцы послали Д’Эрелля в Париж, наблюдать за изготовлением станков для шнапсового завода, но все свободное время он проводил в крупнейшем научном центре - Институте Пастера, работая волонтером, без оплаты. Он так увлекся, что бросил агавы и шнапс, и в 1911 г перевез семью из Мексики в Париж. Перед этим, в этом же году, он еще раз съездил в Мексику, где выделил микроорганизмы из трупов саранчи, массовая гибель которой от неизвестной болезни наблюдалась на полуострове Юкатан.
Выделенный организм, названный Coccobacillus acridiorum, Д Эрелль размножил и испытал против саранчи в Гватемале, Аргентине и Тунисе. То было не очень удачное, но первое в истории использование биологического способа борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур. Эта работа впервые привлекла внимание к Д’Эреллю в ученом сообществе. В 1912 и 1913 году он снова пытался использовать Coccobacillus acridiorum для борьбы с саранчой в Аргентине. После первой мировой войны Д’Эрелль занялся темой, которая сделала его знаменитым. Изучая бактерии, вызывающие дизентерию, он обнаружил инфекционный агент, который вызывал их гибель - лизис. Д’Эреллю удалось наладить его размножение: бактерии, зараженные им, погибали, а количество агента увеличивалось. Д’Эрелль предложил для агента название - «бактериофаг» - пожиратель бактерий.
Д’Эреллю принадлежит также идея использовать бактериофаги для лечения бактериальных заболеваний. В 1919 году Д’Эрелль успешно вылечил фагом первого пациента. В то время еще не было антибиотиков, так что любая попытка найти лекарство от бактерий имела огромное значение. Начался настоящий бум фаговой терапии. В 1920 году Д’Эрелль ездил в Индокитай с целью исследовать холеру и чуму. В это время он все еще работал в Институте Пастера в качестве волонтера. В 1921 году ему удалось издать монографию о бактериофагах. Известность его росла и в 1925 году он, наконец, получил звание почетного доктора Лейденского университета и медаль Левенгука. Однако в Лейденском университете ему предложили лишь временную позицию, и когда срок ее истек, Д’Эрелль уехал бороться с чумой и холерой в Египет. В Египте Д’Эрелль с успехом использовал фаги, которые он собрал у зараженных чумой крыс во время посещения им в 1920 году Индокитая, на зараженных чумой людях. Основываясь на его результатах, Великобритания начала обширную кампанию против чумы.
Затем Д’Эрелль выделил и использовал бактериофаги для лечения холеры в Индии. В 1928 году Д’Эрелль становится профессором в Йельском университете в Нью-Хейвене (США). Тем временем европейские и американские фармацевтические компании наладили производство бактериофагов в медицинских целях и обещали всем фантастические эффекты. Противодействуя им, Д’Эрелль создал французскую компанию, производящую фаги. Однако все компании столкнулись с технологическими проблемами производства. Кроме того, неправильные диагнозы часто приводили к использованию неправильного вида фагов. Все это привело к тому, что научное сообщество отвернулось от Д’Эрелля. К тому же Д’Эрелль имел непростой характер и нажил себе много врагов.
В сложившейся ситуации он принял приглашение И. В. Сталина, в 1934 году приехал в Советский Союз и обосновался в Тифлисе, у знакомого ему по пастеровскому институту грузинского ученого Г. Элиава. В Тбилиси он участвовал в создании НИИ бактериофага (впоследствии НИИ вакцин и сывороток). Д’Эрелль уже начал строить себе дом в Тбилиси, но в 1939 году Г. Элиава был репрессирован, и Д’Эрелль, который, по практике того времени должен был быть неминуемо расстрелян в числе друзей Г. Элиава, чудом успел уехать во Францию и спасти семью.
Тем временем начался век антибиотиков, и фаговая терапия на Западе была почти забыта: фаги гораздо дороже и сложнее в производстве чем, например, пенициллин. Лишь в Советском Союзе, особенно в Грузии велись работы по культуре фага - вплоть до наших дней. Д’Эрелль пережил немецкую оккупацию во Франции и умер в Париже 22 февраля 1949 года, практически забытый как ученый. Но имя Д’Эрелля упомянуто в особом списке людей, кому следовало бы присудить Нобелевскую премию. А интерес к фаговой терапии в последнее время вновь возрастает в связи проблемой устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.
В конце ХХ века стало ясно, что бактерии безусловно доминируют в биосфере Земли, составляя более 90% ее биомассы. У каждого вида имеется множество специализированных типов вирусов. По предварительным оценкам, число видов бактериофагов составляет около 1015. Чтобы понять масштаб этой цифры, можно сказать, что если каждый человек на Земле будет каждый день открывать по одному новому бактериофагу, то на описание всех их понадобится 30 лет.
Бактериофаг
Таким образом, бактериофаги — самые малоизученные существа в нашей биосфере. Большинство известных сегодня бактериофагов принадлежит к отряду Caudovirales — хвостатые вирусы. Их частицы имеют размер от 50 до 200 нм. Хвост разной длины и формы обеспечивает присоединение вируса к поверхности бактерии-хозяина, головка (капсид) служит хранилищем для генома. Геномная ДНК кодирует структурные белки, формирующие «тело» бактериофага, и белки, которые обеспечивают размножение фага внутри клетки в процессе инфекции.
Можно сказать, что бактериофаг — это природный высокотехнологичный нанообъект. Например, хвосты фагов представляют собой «молекулярный шприц», который протыкает стенку бактерии и, сокращаясь, впрыскивает свою ДНК внутрь клетки. С этого момента начинается инфекционный цикл. Его дальнейшие этапы состоят из переключения механизмов жизнедеятельности бактерии на обслуживание бактериофага, размножение его генома, построение множества копий вирусных оболочек, упаковки в них ДНК вируса и, наконец, разрушение (лизис) хозяйской клетки.
Бактериофаг сокращаясь впрыскивается свою ДНК в бактерию
Помимо постоянного эволюционного соревнования механизмов защиты у бактерий и нападения у вирусов, причиной сложившегося равновесия можно считать и то, что бактериофаги специализировались по своему инфекционному действию. Если имеется крупная колония бактерий, где своих жертв найдут и следующие поколения фагов, то уничтожение бактерий литическими (убивающими, дословно — растворяющими) фагами идет быстро и непрерывно.
Если потенциальных жертв маловато или внешние условия не слишком подходят для эффективного размножения фагов, то преимущество получают фаги с лизогенным циклом развития. В этом случае после внедрения внутрь бактерии ДНК фага не сразу запускает механизм инфекции, а до поры до времени существует внутри клетки в пассивном состоянии, зачастую внедряясь в бактериальный геном.
В таком состоянии профага вирус может существовать долго, проходя вместе с хромосомой бактерии циклы деления клетки. И лишь когда бактерия попадает в благоприятную для размножения среду, активируется литический цикл инфекции. При этом, когда ДНК фага освобождается из бактериальной хромосомы, часто захватываются и соседние участки бактериального генома, а их содержимое в дальнейшем может перенестись в следующую бактерию, которую заразит бактериофаг. Этот процесс (трансдукция генов) считается важнейшим средством переноса информации между прокариотами — организмами без клеточных ядер.
Все эти молекулярные тонкости не были известны во втором десятилетии ХХ века, когда были открыты «невидимые инфекционные агенты, уничтожающие бактерий». Но и без электронного микроскопа, с помощью которого в конце 1940-х впервые удалось получить изображения бактериофагов, было понятно, что они способны уничтожать бактерии, в том числе и болезнетворные. Это свойство было незамедлительно востребовано медициной.
Бактериофаг
Первые попытки лечения фагами дизентерии, раневых инфекций, холеры, тифа и даже чумы были проведены достаточно аккуратно, и успех выглядел вполне убедительно. Но после начала массового выпуска и использования фаговых препаратов эйфория сменилась разочарованием. О том, что такое бактериофаги, как производить, очищать и применять их лекарственные формы, было известно еще очень мало. Достаточно сказать, что по результатам предпринятой в США в конце 1920-х годов проверки во многих промышленных фагопрепаратах собственно бактериофагов вообще не оказалось.
Проблема с антибиотиками
Вторую половину ХХ века в медицине можно назвать «эрой антибиотиков». Однако еще первооткрыватель пенициллина Александр Флеминг в своей нобелевской лекции предупреждал, что устойчивость микробов к пенициллину возникает довольно быстро. До поры до времени антибиотикоустойчивость компенсировалась разработкой новых типов противомикробных лекарств. Но с 1990-х годов стало ясно, что человечество проигрывает «гонку вооружений» против микробов.
Виновато прежде всего бесконтрольное применение антибиотиков не только в лечебных, но и в профилактических целях, причем не только в медицине, но и в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и быту. В результате устойчивость к этим препаратам начала вырабатываться не только у болезнетворных бактерий, но и у самых обычных микроорганизмов, живущих в почве и воде, делая из них «условных патогенов».
Такие бактерии комфортно существуют в медицинских учреждениях, заселяя сантехнику, мебель, медицинскую аппаратуру, порой даже дезинфицирующие растворы. У людей с ослабленным иммунитетом, каких в больницах большинство, они вызывают тяжелейшие осложнения.
Неудивительно, что медицинское сообщество бьет тревогу. В прошедшем, 2012 году гендиректор ВОЗ Маргарет Чен выступила с заявлением, предсказывающим конец эры антибиотиков и беззащитность человечества перед инфекционными заболеваниями. Впрочем, практические возможности комбинаторной химии — основы фармакологической науки — далеко не исчерпаны. Другое дело, что разработка противомикробных средств — очень дорогой процесс, не приносящий таких прибылей, как многие другие лекарства. Так что страшилки о «супербактериях» — это скорее предостережение, побуждающее людей к поискам альтернативных решений.
На медицинской службе
Вполне логичным выглядит возрождение интереса к использованию бактериофагов — естественных врагов бактерий — для лечения инфекций. Действительно, за десятилетия «эры антибиотиков» бактериофаги активно служили науке, но не медицине, а фундаментальной молекулярной биологии. Достаточно упомянуть расшифровку «триплетов» генетического кода и процесса рекомбинации ДНК. Сейчас о бактериофагах известно достаточно, чтобы обоснованно выбирать фаги, подходящие для терапевтических целей.
Фотография, сделанная с помощью электронного микроскопа, показывает процесс закрепления бактериофагов (колифагов T1) на поверхности бактерии E. coli
Достоинств у бактериофагов как потенциальных лекарств множество. Прежде всего — это их несметное количество. Хотя изменять генетический аппарат бактериофага тоже намного проще, чем у бактерии, и тем более — у высших организмов, в этом нет необходимости. Всегда можно подобрать что-то подходящее в природе. Речь идет скорее о селекции, закреплении востребованных свойств и размножении нужных бактериофагов.
Это можно сравнить с выведением пород собак — ездовых, сторожевых, охотничьих, гончих, бойцовых, декоративных… Все они при этом остаются собаками, но оптимизированы под определенный вид действий, нужных человеку. Во-вторых, бактериофаги строго специфичны, то есть они уничтожают только определенный вид микробов, не угнетая при этом нормальную микрофлору человека.
В-третьих, когда бактериофаг находит бактерию, которую должен уничтожить, он в процессе своего жизненного цикла начинает размножаться. Таким образом, не столь острым становится вопрос дозировки. В-четвертых, бактериофаги не вызывают побочных эффектов. Все случаи аллергических реакций при использовании терапевтических бактериофагов были вызваны либо примесями, от которых препарат был недостаточно очищен, либо токсинами, выделяющимися при массовой гибели бактерий. Последнее явление, «эффект Герксхаймера», нередко наблюдается и при применении антибиотиков.
Две стороны медали
К сожалению, недостатков у медицинских бактериофагов тоже немало. Самая главная проблема проистекает из достоинства — высокой специфичности фагов. Каждый бактериофаг инфицирует строго определенный тип бактерий, даже не таксономический вид, а ряд более узких разновидностей, штаммов. Условно говоря, как если бы сторожевая собака начинала лаять только на одетых в черные плащи громил двухметрового роста, а на лезущего в дом подростка в шортах никак не реагировала.
Поэтому для нынешних фаговых препаратов нередки случаи неэффективного применения. Препарат, сделанный против определенного набора штаммов и прекрасно лечащий стрептококковую ангину в Смоленске, может оказаться бессильным против по всем признакам такой же ангины в Кемерове. Болезнь та же, вызывается тем же микробом, а штаммы стрептококка в разных регионах оказываются различными.
Для максимально эффективного применения бактериофага необходима точная диагностика патогенного микроба, вплоть до штамма. Самый распространенный сейчас метод диагностики — культуральный посев — занимает много времени и требуемой точности не дает. Быстрые методы — типирование с помощью полимеразной цепной реакции или масс-спектрометрии — внедряются медленно из-за дороговизны аппаратуры и более высоких требований к квалификации лаборантов. В идеале подбор фагов-компонентов лекарственного препарата можно было бы делать против инфекции каждого конкретного пациента, но это дорого и на практике неприемлемо.
Другой важный недостаток фагов — их биологическая природа. Кроме того, что бактериофаги для поддержания инфекционности требуют особых условий хранения и транспортировки, такой метод лечения открывает простор для множества спекуляций на тему «посторонней ДНК в человеке». И хотя известно, что бактериофаг в принципе не может заразить человеческую клетку и внедрить в нее свою ДНК, поменять общественное мнение непросто.
Из биологической природы и довольно большого, по сравнению с низкомолекулярными лекарствами (теми же антибиотиками), размера вытекает третье ограничение — проблема доставки бактериофага в организм. Если микробная инфекция развивается там, куда бактериофаг можно приложить напрямую в виде капель, спрея или клизмы, — на коже, открытых ранах, ожогах, слизистых оболочках носоглотки, ушей, глаз, толстого кишечника — то проблем не возникает.
Но если заражение происходит во внутренних органах, ситуация сложнее. Случаи успешного излечения инфекций почек или селезенки при обычном пероральном приеме препарата бактериофага известны. Но сам механизм проникновения относительно крупных (100 нм) фаговых частиц из желудка в кровоток и во внутренние органы изучен плохо и сильно разнится от пациента к пациенту. Бактериофаги бессильны и против тех микробов, которые развиваются внутри клеток, например возбудителей туберкулеза и проказы. Через стенку человеческой клетки бактериофаг пробраться не может.
Нужно отметить, что противопоставлять применение бактериофагов и антибиотиков в медицинских целях не следует. При совместном их действии наблюдается взаимное усиление противобактериального эффекта. Это позволяет, например, снизить дозы антибиотиков до значений, не вызывающих выраженных побочных эффектов. Соответственно, и механизм выработки у бактерий устойчивости к обоим компонентам комбинированного лекарства почти невозможен.
Расширение арсенала противомикробных препаратов дает больше степеней свободы в выборе методики лечения. Таким образом, научно обоснованное развитие концепции применения бактериофагов в противомикробной терапии — перспективное направление. Бактериофаги служат не столько альтернативой, сколько дополнением и усилением в борьбе с инфекциями.
Бактериофаги и иммунитет
Поскольку бактериофагов в природе несметное количество и они постоянно попадают в организм человека с водой, воздухом и пищей, то иммунитет их просто игнорирует. Существует даже гипотеза о симбиозе бактериофагов в кишечнике, регулирующем кишечную микрофлору. Добиться какой-то иммунной реакции можно лишь при длительном введении в организм больших доз фагов.
Но таким образом можно добиться аллергии на почти любые вещества. И наконец, очень важно, что бактериофаги недороги. Разработка и производство препарата, состоящего из точно подобранных бактериофагов с полностью расшифрованными геномами, культивированных по современным биотехнологическим стандартам на определенных штаммах бактерий в химически чистых средах и прошедших высокую очистку, на порядки дешевле, чем современных сложных антибиотиков.
Это позволяет быстро приспосабливать фаготерапевтические препараты к меняющимся наборам патогенных бактерий и применять бактериофаги в ветеринарии, где дорогие лекарства экономически не оправданы.
Бактериофаги
Бактериофагами называют вирусы, живущие в бактериях.
Бактериофаги (от бактерии и греч. phagos — пожиратель; буквально — пожиратели бактерий), фаги, бактериальные вирусы, вызывающие разрушение (лизис) бактерий и других микроорганизмов. Бактериофаги размножаются в клетках, лизируют их и переходят в др., как правило, молодые, растущие клетки. Впервые перевиваемый лизис бактерий (сибиреязвенной палочки) наблюдал в 1898 русский микробиолог Н. Ф. Гамалея. В 1915 английский учёный Ф. Туорт описал это же явление у гнойного стафилококка, а в 1917 французский учёный Ф. Д"Эрелль назвал литический агент, проходящий через бактериальные фильтры.
Строение и химический состав. Частицы многих бактериофагов состоят из головки округлой, гексагональной или палочковидной формы диаметром 45—140 нм и отростка толщиной 10—40 и длиной 100—200 нм. Другие бактериофаги не имеют отростка; одни из них округлы, другие — нитевидны, размером 8х800 нм. Содержимое головки состоит преимущественно из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) (длина её нити во много раз превышает размер головки и достигает 60—70 мкм, эта нить плотно скручена в головке) или рибонуклеиновой кислоты (РНК) и небольшого количества (около 3%) белка и некоторых других веществ. Отросток имеет вид полой трубки, окруженной чехлом, содержащим сократительные белки, подобные мышечным. У ряда бактериофагов чехол способен сокращаться, обнажая часть стержня. На конце отростка у многих бактериофагов имеется базальная пластинка с несколькими шиловидными или другие формы выступами. От пластинки отходят тонкие длинные нити, которые способствуют прикреплению фага к бактерии. Оболочки головки и отростка состоят из белков. Общее количество белка в частице фага 50—60% , нуклеиновых кислот — 40—50% . Каждый бактериофаг обладает специфическими антигенными свойствами, отличными от антигенов бактерии-хозяина и других фагов. Имеются антигены, общие для ряда фагов (особенно содержащих РНК).
Распространение. Бактериофаги найдены для большинства бактерий, в том числе патогенных и сапрофитных, а также.для актиномицетов (актинофаги) и сине-зелёных водорослей. Встречаются бактериофаги в кишечнике человека и животных, в растениях, почве, водоёмах, сточных водах, навозе и т. д. Бактериофаги почвенных микроорганизмов влияют на течение микробиологических процессов в почве.
Размножение. Бактериофаг прикрепляется своим отростком к бактериальной клетке и, выделяя фермент, растворяет клеточную стенку; затем содержимое его головки через канадец отростка переходит внутрь клетки, где под влиянием нуклеиновой кислоты фага останавливается синтез бактериальных белков, ДНК и РНК и начинается синтез нуклеиновой кислоты, а затем и белков фага. Часть этих белков — ферменты, другая часть образует оболочку зрелой частицы бактериофага Более мелкие, сферические фаги попадают в бактерии без участия отростка. Если клетка бактерии заражена одновременно частицами бактериофага, различающимися между собой по ряду свойств, то среди потомства, кроме частиц, подобных родителям, будут и такие, у которых эти свойства встречаются в новой комбинации, т. к. при размножении бактериофагов наблюдается
рекомбинация — обмен кусками нитей нуклеиновой кислоты, являющейся носителем наследственной информации. Частицы крупных фагов выходят из бактерии, разрушая её, а некоторых мелких и нитевидных — из живых бактерий. Одни бактериофаги весьма специфичны и способны лизировать клетки только одного какого-либо вида микроорганизмов (монофаги), другие — клетки разных видов (полифаги).
Бактериофагов делят на вирулентные, вызывающие лизис клетки с образованием новых частиц, и умеренные (симбиотические), которые адсорбируются клеткой и проникают в неё, но лизиса не вызывают, а остаются в клетке в латентной (скрытой) неинфекционной форме (профаг). Культуры, содержащие латентный фаг, называются лизогенными. Лизогения передаётся потомству бактерии. Лизогенная культура может содержать 2—3 и более фагов; она, как правило, устойчива против находящихся в ней фагов (лишь небольшая часть клеток лизируется и освобождает зрелые фаги). Воздействуя на лизогенную культуру ультрафиолетовыми или рентгеновскими лучами, перекисью водорода и некоторыми другими веществами, можно значительно увеличить количество клеток, освобождающих фаг (т. н. индукция бактериофагов). Лизогения широко распространена среди всех видов бактерий и актиномицетов. В ряде случаев многие свойства лизогенной культуры (токсичность, подвижность бактерий и др.) зависят от наличия в ней определённых профагов. Описано много мутаций бактериофагов, сопровождающихся изменением их литической активности, строения частиц и «колоний», устойчивости против неблагоприятных воздействий и другие свойств. Бактериофаги играют большую роль в изменчивости и эволюции микробов, причём механизмы воздействия их на клетку разные. Бактериофаги могут резко изменять азотфиксирующую способность азотобактера, токсичность и антигенные свойства патогенных бактерий и др.
Практическое значение бактериофагов Некоторые фаги (одни или в сочетании с антибиотиками) применяли для профилактики (фагопрофилактики) и лечения (фаготерапии) ряда бактериальных инфекционных болезней человека (дизентерия, брюшной тиф, холера, чума, стафилококковые и анаэробная инфекции и др.) и животных. Однако антибиотики и другие химиотерапевтические средства оказались эффективнее фагов, в связи с чем применение их с лечебной целью сузилось. Бактериофаги успешно применяются при определении вида бактерий, актиномицетов. Бактериофаги могут вредить производству антибиотиков, аминокислот, молочных продуктов, бактериальных удобрений и в других отраслях микробиологического синтеза. Велико значение бактериофагов для теоретических работ по генетике и молекулярной биологии.